BÀI THÍ NGHIỆM SỐ 4
XÁC ĐỊNH PROTEIN THEO PHƯƠNG PHÁP BRADFORD
NGUYÊN TẮC

Tìm hiểu sơ lược về protein và Coomasie Brilliant Blue G-250
Protein
Là những đại phân tử được cấu tạo theo nguyên tắc đa phân mà các đơn phân là axít amin
Chúng kết hợp với nhau thành một mạch dài nhờ các liên kết peptide (gọi là chuỗi polypeptide). Các chuỗi này có thể xoắn cuộn hoặc gấp theo nhiều cách để tạo thành các bậc cấu trúc không gian khác nhau của protein.
Dưới tác dụng của các tác nhân vật lý như tia cực tím, sóng siêu âm, khuấy cơ học... hay tác nhân hóa học như axit, kiềm mạnh, muối kim loại nặng,... các cấu trúc bậc hai, ba và bậc bốn của protein bị biến đổi nhưng không phá vỡ cấu trúc bậc một của nó, kèm theo đó là sự thay đổi các tính chất của protein so với ban đầu.
Có tính kị nước do các gốc kỵ nước của các acid amin(aa) trong chuỗi polipeptit của protein hướng ra ngoài các gốc này liên kết với nhau tạo liên kết kỵ nước.

Coomasie Brilliant Blue G-250
Coomassie Brilliant Blue G-250 là một trong hai hình thức hóa học của một hợp chất triphenylmethane disulfonated
Công thức phân tử: C47H50N3O7S2+; Khối lượng phân tử: 833.0458 [g/mol]
thường được sử dụng như một loại thuốc nhuộm để phát hiện protein trong phương pháp điện di gel và Bradford để xác định lượng protein.  G-250 tạo phản ứng màu với protein (màu xanh),nên nó còn được gọi là thuốc nhuộm Coosamie
Nhuộm bằng Coomassie Brilliant Blue G- 250 là phương pháp nhuộm phổ biến nhất thường được sử dụng phát hiện protein trên gel polyacrylamide (Wilson,1983). Rất dễ phát hiện khi có khoảng 0,1  –  1  µg protein trên băng
Tùy theo hàm lượng protein mà ta có thể thay đổi tỉ lệ thành phần các chất cũng như chất nhuộm.
Đối với Coomassie Brilliant Blue G- 250 nên sử dụng để nhuộm đối với những protein có trọng lượng phân tử polypeptide thấp
Bản chất của phản ứng
Nguyên tắc: Phương pháp này dựa vào sự thay đổi màu xảy ra khi Coomassie Brilliant Blue G – 250 liên kết với protein trong dung dịch axit. Dạng proton hoá của thuốc nhuộm Coomassie Blue có màu đỏ da cam. Thuốc nhuộm liên kết chặt chẽ với các protein, tương tác với cả nhóm kỵ nước và các nhóm mang điện tích dương trên phân tử protein. Trong môi trường của các gốc mang điện tích dương, sự proton hoá không xảy ra và có màu xanh xuất hiện.
Các protein khi phản ứng xanh Coomassie sẽ hình thành hợp chất màu có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sống 595nm (hấp thụ cực đại ở bước sống này)
Đặc điểm của phản ứng
Cường độ màu tỉ lệ với nồng độ protein trong dung dịch.Nồng độ Protein càng cao thì màu xanh càng đậm
Không phụ thuộc vào nồng độ acid amin của dung dịch
Phương pháp có độ nhạy cao cho phép phát hiện tới vài (g protein/ml.Nhạy hơn phương pháp Lowry gấp 4 lần
Dễ phát hiện và tiết kiệm thời gian
Ít bị ảnh hưởng bởi các chất thường gặp trong tế bào chẳng hạn như muối


THỰC HÀNH
Hóa chất cần dùng
Dung dịch mẫu cần xác định
Dung dịch albumin 1mg/ml
Cân chính xác 10mg albumin pha loãng 1ml nước cất
Lắc đều cho tan,giữ ở 20oC để tạo dung dịch có nồng độ 0.1mg/ml
Dung dịch thuốc thử Bradford
Coomasie Brilliant Blue G-250 :0.001g
Ethanol 990
Acid phosphoric 85% :8.5g
Phẩm màu CBB



Click tải về PDF

Word

Cám ơn bạn nha <3
^^